Идентификация бактерий, выделенных в грунте прибрежной зоны Кольского залива

Автор: Филиппова Елена, 11 мед., МПЛ

Научный руководитель:  Перетрухина А.Т., зав. кафедрой биологии Мурманского государственного
 Технического университета, профессор,
 член-корреспондент РНАН,
кандидат биологических наук

г. Мурманск

Введение.

В работе исследовались пробы грунта литорали Кольского залива в районе Белокаменки. Из проб производилось поэтапное выделение чистых культур микроорганизмов, являющихся естественной микрофлорой литорали, их исследование и идентификация. Выделение чистой культуры микробов - обязательный этап всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма. Выделение чистых культур микроорганизмов и их последующая идентификация называется бактериологическим методом исследования. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды.Целью работы явилось выделение чистых культур микроорганизмов, являющихся естественными для воды и грунта литорали Кольского залива, исследование культуральных, морфологических, ферментативных свойств для идентификации и установления родовой и видовой принадлежности данных микроорганизмов. Результаты работы могут лечь в основу более качественной оценки санитарного состояния воды Кольского залива, особенностей функционирования бактериальных популяций в воде и грунте литорали Кольского залива. Теоретические сведения.   Чистая культура- скопление клеток одного вида ( потомство одной микробной клетки ), образовавшееся в результате размножения на питательной среде. Изучение свойств микроорганизмов и установление их видовой принадлежности возможно только при их выращивании в чистой культуре. Основная задача при выделении чистых культур из смеси различных микробов - получение изолированных микробных колоний, что достигается разделением клеток на поверхности агара. В процессе эксперимента для выделения чистых культур микроорганизмов был использован метод Дригальского, основанный на механическом разобщении микробных колоний на поверхности плотной питательной среды, где каждая клетка фиксируется на определенном месте, размножается, в результате чего через 2-3 дня образуется колония, представляющая собой скопление особей одного вида. Для посева используют несколько чашек Петри с плотной питательной средой. На поверхность застывшей среды в первую чашку петлей или пипеткой вносят каплю исследуемого материала. Затем с помощью стеклянного стерильного шпателя или бактериологической петли растирают по всей поверхности среды; этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды во второй и третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются. Путем отвивки изолированных колоний из чашки Петри на стерильную питательную среду и последующего термостатирования получают чистую культуру. Посев чистых культур на агар в чашках Петри производят с помощью бактериологической петли и шпателя на застывший в чашке агар или посредством выливания расплавленного и остуженного до 45°С агара в стерильную чашку, в которую был до этого внесён посевной материал пипеткой. После посева штативы с пробирками и чашки Петри ставят в термостаты для выращивания при оптимальной для микробов температуре.

Изучение свойств микроорганизмов

1)Культуральные свойства - это внешний  вид  колоний В процессе эксперимента выращивали  культуры  на плотной питательной среде. Для изучения свойств колоний микробы культивируют на 1,5-2% мясо-пептонном агаре в чашках Петри. Если выращиваемый микроб на простом агаре не растёт, пользуются специальными питательными средами. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооружённым глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженной диафрагмой. Колонии характеризуют по следующим признакам: величина колонии, её форма, характер контура края, рельеф, поверхность, цвет, структура, консистенция.

2) Ставили опыт на изучение ферментативной активности с целью установления не только типовой и видовой принадлежности микроба, но и определения его вариантов (так называемых биоваров). Основные изучаемые свойства:а)сахаролитическая активность (способность расщеплять углеводы);б)протеолитические свойства (способность расщеплять белки, полипептиды и т.д.);в)гемолитические свойства (способность разрушать эритроциты).

3)Морфологические свойства определяются после окрашивания и микроскопирования фиксированного препарата:

а)основными формами бактерий принято считать шаровидную;палочковидную; извитую;

б)подвижность бактерий обусловлена наличием или отсутствием жгутиков- пилей, наличием или отсутствием скользящего движения.;

в) наличие или отсутствие спор или капсул является характерным морфологическим признаком;

г) Окраска по Граму является одним из основных морфологических свойств, определяющих ту или иную принадлежность по систематике.

Для выращивания чистых культур микроорганизмов использовались различные питательные среды. Например: рыбный бульон, солевой бульон, молочно-солевой агар, трёхсахарный агар, рыбо- пептонный агар, среды Кода, Эндо, ВСА ( висмут- сульфид агар ), лактоза с ВР.

Порядок проведения исследования

1-й день исследований: пробу грунта литорали Кольского залива отбирали стерильным шприцем, переносили в стерильную колбу, затем заливали 100г стерильной воды, после тщательного перемешивания переносили 1 г смыва в пробирки со средами Кода и СБ, термостатировали при температуре 37°С  24 часа.

2- й день исследований: из пробирок бактерицидной петлей, профламбированной над открытым огнём спиртовки, брали материал и производили посев на чашки Петри с плотными средами по методу Дригальского, термостатировали при температуре 37°С  24 часа.

3- й день исследований: из последних третьих чашек Петри, где выросли изолированные колонии, отбирали бактерицидной петлёй отдельную колонию и производили посев на скошенный агар. Описывали культуральные свойства микроорганизмов.

4- й день исследований: колонию с косяка фиксировали на предметном стекле, окрашивали и микроскопировали, записывали морфологические свойства. Ставили опыт на исследовании ферментативной активности культуры («цветной ряд» ).

5- й день исследований: контролировали изменения сред в пробирках, делали вывод о наличии или отсутствии ферментативной активности. Сделали вывод о родовой и видовой принадлежности.

Результаты исследований

Собрав воедино сведения по культуральным, морфологическим и ферментативным свойствам, нами сделан вывод о том, что в грунте литорали Кольского залива присутствуют бактерии рода BACILLUS: а) культуральные: гладкие, матовые, круглые колонии, рельеф выпуклый, края волнистые, бледные, беловатые, поверхность шероховатая, консистенция слизистая, склонны к зарастанию среды; б) морфологические: гр.+, спора+, крупные, зернистые палочки, подвижные; в) ферментация: глюкоза+;лактоза-;молоко+;редуктаза+;оксидаза-;каталаза+; H2S+; NH3 +; желатина+; малонат-;маннит-;цитрат-;ацетат-;ф/а-; подвижность+;

Bacillus egatherium.

BACILLUS:

а) культуральные: края неровные, по форме круглые, неправильные, рельеф каплеобразный, цвет серовато- белый, поверхность неровная, консистенция слизистая;

б) морфологические: гр.+, спора+, крупные палочки;

в) ферментация: глюкоза+; лактоза; молоко+; редуктаза+; оксидаза-; каталаза+;H2S+; NH3+, желатина+; малонат-; маннит+; цитрат-, ацетат-; ф/а-;подвижность+;

Bacillus cereus.

PSEVDOMONAS :

а) культуральные: круглая форма, рельеф плоский, поверхность ровная, края ровные, цвет к более светлым оттенкам, встречались бесцветные, консистегнция слизистая;

б) морфологические: гр.+, палочковидная, средней длины, в мазках встречаются чуть изогнутые, расположены поодиночке и длинными цепочками по 2- 3 клетки, без спор и капсул;

в) ферментация: глюкоза+; лактоза-; молоко+; редуктаза+;оксидаза-;   каталаза+; H2S; NH3; желатина+; малонат-; маннит-; ацетат-; ф/а; подвижность+

Psevdomonas aeruginosa.

Обнаружение качественного состава является важной задачей для изучения функционирования экосистемы литорали Кольского залива. Выделение и идентификация некоторых видов микроорганизмов произведено в Кольском заливе впервые. Выводы приближают нас к пониманию процесса формирования структуры грунта литорали Кольского залива и качественного состава микрофлоры воды.

Вывод

В грунте литорали Кольского залива обитают микроорганизмы  Psevdomonas aeruginosa, Bacillus megatherium, Bacillus cereus. Bacillus cereus и Psevdomonas aeruginosa являются условно патогенными микроорганизмами, могут вызывать пищевые отравления. Bacillus megatherium- распространённый в почве сапрофитный микроорганизм. Рекомендации: следить за санитарным состоянием воды Кольского залива, продолжать работу по исследованию видовой принадлежности бактерий, обитающих в воде и грунте литорали Кольского залива.

Список используемой литературы:

1.        Дутова Е.Н., Гофтарш М.М., Призренова И.И., Сазонова А.С.; Техническая микробиология рыбных продуктов,- М.: Пищевая промышленность, 1976.-270с.

2.        Лабинская А.С.; Микробиология с техникой микробиологических исследований.- М.: Медицина, 1971.- 500с.

3.        Определитель бактерий Берджи. В 2- х томах.Т.1., Т.2., Пер. с англ. под ред. Г.А.Заварзина./ Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уильямса. Девятое изд.- М.: Мир, 1997,-432с.,368с.

4.        Перетрухина А.Т. Практикум по общей микробиологии: Учеб. пособие.- Мурманск, 1997,-170с.-( Гос. Ком. Рос. Федерации по рыболовству. МГТУ).

5.        Санитарная микробиология.  /  Н.В.Билетова, Р.Н. Корнелаева, Л.Г. Кострикина и др. / под ред. Любащенкою- М.: Пищ. пром- сть, 1980.-352с.