Работа

Разработка диагностических дисков для определения чувствительности грибов к пимафуцину

Автор: Кизюн Екатерина, Бузина Ольга,
средняя школа №2, 10а класс

Научные руководители: Челышева Г.М, к. б. н.,
доцент кафедры микробиологии Новокузнецкого
института усовершенствования врачей;
Ананьина Т.И., учитель биологии высшей категории

г. Новокузнецк Кемеровской области

I. Введение.

В последние годы значительно расширился рынок поступления медицинских препаратов в нашу страну, в частности противомикробных средств. Поэтому при выборе наиболее эффективного препарата особое значение приобретают лабораторные данные о чувствительности (устойчивости) к нему возбудителя инфекции.

Для определения чувствительности микробов к антибактериальным средствам существует ряд методов, рекомендованных “Методическими указаниями по применению унифицированных методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам”, утверждёнными приказом Минздрава СССР № 250 от 13 марта 1975 г. Из них наиболее широкое применение, как у нас в стране, так и за рубежом, нашел метод диффузии в агар с использованием картонных дисков, содержащих антибактериальные препараты. Данный метод принят в качестве официального в 1961г. Всемирной Организацией Здравоохранения ( ВОЗ). С помощью диско-диффузионного метода можно относительно быстро, просто и с достаточной степенью точности установить категорию чувствительности выделенных микроорганизмов, что позволяет выбрать наиболее рациональную схему лечения и, таким образом , обеспечить сокращение сроков лечения больных, существенного уменьшить необоснованный расход лекарственных средств.

В настоящее время перечень выпускаемых дисков с противогрибковыми препаратами в России составляет не более 2-3 наименований . На кафедре микробиологии Новокузнецкого ГИДУВа разработаны диски с такими противогрибковыми препаратами, как нистатин, леворин, амфотерицин В.

Цель нашей работы состояла в разработке дисков с новым противогрибковым препаратом пимафуцином. Основными задачами являлись: выбор оптимального содержания пимафуцина в дисках, отработка технологии приготовления дисков, разработка методики постановки анализа и оценки полученных результатов.

II Общая характеристика пимафуцина и

чувствительных к нему грибов.

Действующим веществом является натамицин-противогрибковый пентаеновый антибиотик группы макролидов,имеющий широкий спектр действия. К натамицину чувствительны большинство патогенных дрожжевых грибов,особенно Candida albicans. Препарат применяется при грибковых заболеваниях кожи и слизистых оболочек,в том числе: грибковых заболеваниях ротовой полости; наружных отитах, вызванных грибами или осложнённых кандидозом; кандидозах кожи и ногтей, кишечника; вагинитах, вульвитах, вульвовагинитах, вызванных грибами рода Сandida; дерматомикозах.

Род Candida относится к семейству Cryptococcaceae класса несовершенных грибов. По морфологии- это крупные круглые или овальные клетки. Грамположительны. Образуют почки, бластоспоры, иногда хламидоспоры. Растут на плотных и жидких мясопептонных средах с глюкозой ( среда Сабуро ) при pH 6,0 - 6,5 ,температуре 20 - 27°С , но могут размножаться при более высоких температурах и значениях pH. На плотных средах формируют крупные гладкие выпуклые белого цвета колонии.

В настоящее время дрожжеподобные грибы рода Candida являются возбудителями основной массы внутрибольничных микозов. Микозы- это комплекс заболеваний, осложнённых рядом медецинских, экологических и экономических проблем. Активизации грибов, находившихся в организме, способствует применение массивных доз антибиотиков, неполноценное питание, грипп, алкоголические заболевания, снижение иммунитета, радиоактивное облучение и другие экологические факторы.

Селекции внутрибольничных штаммов грибов способствует развитие у них устойчивости к применяемым противогрибковым препаратам. Например, широкое использование амфотерицина в медицинской практике привело к снижению чувствительности к нему у грибов рода Candida в 14,3% случаев. Таким образом, разработка дисков к противогрибковым препаратам является актуальной и практически важной задачей.

III. Материалы и методы исследований.

В исследованиях использовали 30 культур грибов рода Candida, выделенных в больницах г. Новокузнецка от амбулаторных и стационарных больных из различного клинического материала. Дополнительно нами проводилась микроскопия мазков, окрашенных по Граму. Наличие почкующихся клеток, псевдомицелия, а также характер роста на плотной среде Сабуро с добавлением 50 мкг/мл левомицетина, наличие хламидоспор служило основанием для заключения о наличии грибов рода Candida.

Для приготовления дисков использовали коммерческий препарат пимафуцин ( фирма Yamanouchi,Нидерланды) и картон фильтровальный технический ГОСТ 6722-75 ( ПО “Кировбумпром), применяемый для промышленного выпуска дисков с антибиотиками.

Изучение антибактериальной активности пимафуцина проводили методом двукратных серийных разведений в плотной среде Сабуро. Микробная нагрузка исследуемых культур составляла 10⁷ кл/мл ( одномиллиардную взвесь каждой культуры, приготовленную по стандарту мутности 10 ЕД разводили в 100 раз ). Антибактериальное действие препарата оценивали по его минимальным подавляющим рост грибов концентрациям (МПК ).

Методика проведения опытов с использованием дисков заключалась в следующем . В чашки Петри, расположенные на строго горизонтальной поверхности, наливали 20 мл расплавленной среды,подсушивали 40-60 минут при комнатной температуре с приоткрытыми крышками, после чего на поверхность агара наносили одномиллиардную взвесь культуры гриба, приготовленную на изотоническом растворе хлорида натрия смывом агаровой культуры. Чашки снова подсушивали 15-20 минут, затем на поверхность засеянной среды накладывали диски с пимафуцином. Чашки в перевёрнутом виде ииииинкубировали 24 часа при температуре 35-37°С. Зоны угнетения роста культур измеряли линейкой с точностью до 1мм, рассчитывали средние арифметические зон и их стандартные ошибки. При разработке методики определения чувствительности грибов к пимафуцину диско-диффузионным методом использовали статистическую обработку экспериментальных данных по Стьюденту.

IV.Результаты собственных исследований.

Что касается величины зон, то они существенно колебались на различных питательных средах ( рис. 2). Наибольшие диаметры зон отмечены на среде АГВ ( 17-18,6 мм.), достоверно меньше на МПА ( 14,8-16,6 мм.) и меньше всего на среде Сабуро ( 14,0- 15,6 мм.). Поэтому для оценки результатов анализа нами рекомендованы следующие значения диаметров зон в зависимости от сред: на среде Сабуро к чувствительным относят штаммы с зонами угнетения роста от 14мм, и выше, на среде АГВ -от 17мм. и выше, и на среде МПА- от 14мм. и выше, т.к. статистически достоверных различий в диаметрах зон на среде Сабуро и МПА не отмечено.

Для установления оптимального способа, нанесения микробной взвеси на поверхность питательной среды использовали нанесение культуры тампоном (однократное смачивание) и нанесение взвеси пипеткой( 1-2мл. с последующим отсасыванием) по методике, рекомендуемой для определения чувствительности к антибиотикам. Показано(рис. 3), что лучшие результаты получаются при нанесении одномиллиардной взвеси тампоном (зоны от 15,1 до 16,2мм.). Зоны, формирующиеся при нанесении взвеси пипеткой статистически ниже, и в этом случае видимо требуется дополнительное разведение взвеси.

Изучено влияние длительности прединкубации чашек Петри с дисками при комнатной температуре и в условиях холодильника на формирование зон угнетения роста культур грибов. Установлено (рис.4), что диски с пимафуцином не нуждаются в прединкубации ни при комнатной температуре, ни в условиях холодильника, т.к. она не влияет существенным образом на формирование зон.

Таким образом, при разработке дисков с пимафуцином выбрано оптимальное содержание препарата в дисках, отработаны некоторые условия методики постановки анализа и оценки полученных результатов. Работа по разработке инструкции по применению дисков с пимафуцином продолжается.

IV Результаты сбственных исследований.

В доступной литературе сведений о дисках с пимафуцином для определения чувствительности к нему патогенных грибов не выявлено.

При изучении противогрибкового действия пимафуцина показано, что препарат обладает высокой активностью в отношении грибов рода Candida ( МПК-1,56-3,12 мкг/мл ) (таблица № 1 ).Устойчивых штаммов не выявленно.

При выборе оптимального содержания пимафуцина в дисках предварительно готовили диски с различным содержанием препарата примерно в 10-40 раз выше МПК. Для этого чистые стерильные диски диаметром 6мм пропитывали водной суспензией пимафуцина определённой концентрации и высушивали. При выборе концентрации микробная нагрузка суточных агаровых культур грибов в изотоническом растворе хлорида натрия составляла 10⁹ клеток/мл по стандарту мутности 10 ЕД. Взвеси на подсушенные чашки наносили тампоном и растирали в трёх направлениях. Чашки с дисками оставляли при комнатной температуре на один час, а затем инкубировали при температуре 35-37° в течении 18 часов.В опытах использовали диски, содержащие 20, 30, 40, 50, 80 мкг препарата . Как видно из таблицы 2 и рисунка 1 увеличение препарата в дисках с 20мкт до 80мкг не приводило к статистически достоверному увеличению диаметров зон угнетения роста испытуемых культур. Средние диаметры зон колебались в пределах от 15,6мм до 16,8мм.Проанализировав результаты опытов, учитывая МПК штаммов грибов, а также создающиеся в организме лечебные дозы препарата, мы сделали заключение, что для определения чувствительности грибов к пимафуцину можно использовать диски с содержанием препарата 30мкг/диск.

Методика определения чувствительности грибов к пимафуцину диско-диффузионным методом разрабатывалась нами в соответствии с рекомендациями ВОЗ по определению чувствительности микроорганизмов к противогрибковым средствам и методическим письмом “Опредиление чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом”.

При определении степени чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам существенное влияние на размеры и качества зон угнетения роста оказывает состав питательной среды. Поэтому нами изучена возможность применения других,кроме среды Сабуро, питательных сред: АГВ и мясопептонного агара, приготовленного из коммерческого сухого питательного агара. Результаты экспериментов показали, что на всех испытуемых средах образуются плотный газон роста культур грибов и хорошо очерченные зоны.

Литература.

1.Справочник Видаль: лекарственные препараты в России-АвстрафармСервис,-М, 1996.

2. Медицинская микробиология //под ред. акад. В.И. Покровского и проф. О.К. Поздеева -ГЕОТАР Медицина, М., 1998.

3.Требования к испытаниям на чувствительность к противомикробным средствам .-В кн.:Комитет Экспертов ВОЗ на стандартизации биологических препаратов // серия технических докладов 673.-ВОЗ: Женева, 1984.-32-ой доклад, с.135-169.

4. Инструктивно-методические указания.-М.: МЗ СССР, Минмедпром, 1984,-вып.3.

таблица №1
Фунгицидная активность пимафуцина в отношении клинических штаммов грибов рода Candida.
Число	Число культур с МПК ( мкг/мл ).
изученных	1,56		3,12
штаммов.	абс	%	абс	%
30	20	66,7	10	33,3

Таблица №2
Активность дисков с пимафуцином, содержащих различные концентрации препарата, в отношении грибов рода Candida.
Cодержание антибиотика в диске ( мкг)	Средние диаметры зон угнетения роста (мм)с доверительными границами при Р =0,05
20	16,0 ( 15,4¸16,6 )
30	16,1 ( 15,0¸17,2)
40	16,0 ( 14,9¸17,1)
50	15,6 ( 15,0¸16,2)
80	16,8 ( 16,1¸17,5)