Молекулярно-генетическое изучение мутаций у больных фенилкетонурией
Автор: Мунасыпов
Тимур Ахатович, Станция
юных натуралистов Октябрьского района
Научный руководитель: Фатхисламова Рита Игоревна
г. Уфа
ВВЕДЕНИЕ
Изучение молекулярных основ моногенных
наследственных болезней человека и их распространение в различных регионах является
одной из актуальных проблем медицинской
генетики и генетики человека. В настоящее
время описано свыше 1000 наследственных болезней человека, обусловленных генными мутациями. Классическим
примером заболевания, относящемуся к
классу нарушений аминокислотного обмена является фенилкетонурия (ФКУ). Причиной
данного аутосомно-рецессивного заболевания является поражение гена фенилаланингидроксилазы(ФАГ),
что ведет к инактивации фермента
фенилаланингидроксилазы и блокированию гидроксилирования
фенилаланина (ФА), то есть превращения его в тирозин. При ФКУ поражается, главным образом, центральная
нервная система детей, что
необратимо ведет к их тяжелой умственной отсталости. Ранняя диагностика ФКУ (до 1 года жизни) и своевременная
терапия (искусственная бесфенилаланиновая
диета) предупреждают развитие болезни.
Частота ФКУ существенно варьирует в
различных регионах и этнических группах от 1:2600 до
1:120000 (Woo et al.,. 1992). В Башкортостане частота ФКУ составляет 1:10707 (Магжанов, 1994),
В настоящее время в гене ФАГ выявлено
более 420 различных мутаций, частота и встречаемость которых
характеризуется высокой гетерогенностью и существенными
межпопуляционными различиями (Carter et al., 1998). Наиболее распространенной мутацией гена ФАГ в европейских популяциях и не найденная в Японии и Китае является миссенс-мутация R408W, генетический
дефект которой связан с заменой С (цитозина) на Т (тимин) в 12 экзоне, ведущей к замене аргинина на триптофан в
408-положении белка ФАГ .
Высокая частота ФКУ в Башкортостане и тяжесть ее
клинических проявлений показывают
необходимость определения генетической природы этого заболевания в данной популяции с определением доминирующих мутаций, что позволит выявить гетерозиготных носителей
заболевания и осуществить
эффективную пренатальную диагностику ФКУ в пораженных семьях.
Целью исследования явилось изучение
мутации R408W в
гене фенилаланингидроксилазы, у больных, в семьях высокого риска и у
здоровых доноров из Волго-Уральского региона.
В соответствии с целью исследования
были поставлены следующие задачи.
1. Обобщить сведения, имеющиеся в литературе по
проблеме фенил кетонурии .
2. Определить частоту встречаемости в семьях с ФКУ доминирующей у европеоидов мутации R408W гена ФАГ.
Работа проводилась в лаборатории молекулярной
генетики человека Института Биохимии и Генетики УНЦ РАН.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ФКУ - это тяжелое аутосомно-рецессивное
заболевание, обусловленное наследственным дефектом фенилаланингидроксилазы и
характеризующееся умственной отсталостью у больных, не
получающих своевременного адекватного лечения. Биохимической
основой ФКУ является нарушение нормального гидроксилирования L-фенилаланина
в тирозин вследствие дефицита фермента печени ФАГ, что
приводит к накоплению ФА (гиперфенилаланинемии) и активации
вспомогательных путей его распада. Характерные для ФКУ
биохимические нарушения начинают развиваться сразу после
рождения ребенка и при отсутствии с самых первых дней жизни безфенилаланиновой диеты ведут к поражению мозга. Главным симптомом болезни является слабоумие, которое достигает у большой части больных степени идиотии и имбицильности и ведет к тяжелой
психической инвалидности.
Ген ФАГ картирован на длинном плече хромосомы 12 в области q22-q24. Кодирующая белок последовательность
(кДНК) включает около 90 кб и содержится в 13 экзонах. Интроны разделяют
кодирующие белок ФАГ участки гена на экзоны длиной от 57 до 892 п.о., средняя
длина которых составляет 114±43 п.о. Все интроны гена ФАГ начинаются и
заканчиваются каноническими GT и AG динуклеотидами, соответственно.
Конечные 17 нуклеотидов 3 конца каждого интрона содержат только один AG динуклеотид и богаты пиримидинами. 6-13 экзоны
компактно
уложены в фрагмент гена размером 20 кб, в то время как 1-5 экзоны разделены большими нитронами, размеры
которых колеблются от 3 до 23 кб.
Большинство изменений в гене ФАГ,
вызывающих заболевание, являются одноосновными
(однонуклеотидными) заменами, включая миссенс (64%), сплайсинг (13%) и нонсенс
(6 %) мутаций и нейтральных полиморфизмов
(6%). Почти 20 миссенс-мутаций затрагивают высокомутагенные CpG динуклеотиды. Остальные мутации возникают в результате
делеций или инсерций различных типов. Наиболее частыми являются делеций целого экзона, возникающие вследствие пропуска экзона из-за
сплайсинга (Marvit et al., 1987) или других мутаций вблизи границ интрон-экзон (13%). Так,
у йеменских евреев с ФКУ выявлены крупные делеций,
вызывающие потерю примерно 7 кб экзона 3 и региона, фланкирующего интрон (Avigad et al., 1990). У больных ФКУ из Шотландии обнаружена
деления региона, включающего 1 и 2 экзоны (Sullivan et al., 1985). Третий тип
крупной делеций, затрагивающей 5 и 6 экзоны гена ФАГ, выявлена у нескольких ФКУ пациентов из Японии (Okano et al., 1994). Более маленькие делеций включают делецию 22 п.о. в 6 экзоне, делецию 15 п.о. внутри рамки считывания в 11 экзоне (Jaruzelska et al., 1993), делецию 11 п.о. в 7 экзоне, вызывающую сдвиг рамки считывания, что
приводит к преждевременному
стоп-сигналу в 278 кодоне (Dworniczak et al., 1992), 3 однокодоновые
делеции (Svensson et al., 1990; Guldberg et al., 1993), 4 двухнуклеотидные делеции (Guldberg et al., 1993; Benit et al., 1994) и 10 однонуклеотидных делеции
(Guldberg et al., 1993; Benit et al., 1994). В гене ФАГ было выявлено только три инсерции. Две возникают вследствие образования новых сайтов сплайсинга, вызванных миссенс-мутациями внутри нитронов (Dworniczak et al., 1991), а
третий тип инсерции происходит в результате инсерции 4 п.о. в 10
экзоне.
В настоящее время в мире выявлено свыше 328 мутаций гена
ФАГ, распределение которых значительно
различается в разных странах.
Из рациона больного ФКУ во время диетотерапии исключаются
все продукты, содержащие большое количество
ФА (мясные и молочные продукты,
хлебобулочные и кондитерские изделия, яйца, орехи, бобовые и др.). Для удовлетворения потребности в калориях
больные должны употреблять как можно
больше продуктов растительного происхождения (углеводы и ненасыщенные жирные кислоты).
Индивидуальные потребности ФА
устанавливаются в самом начале лечения путем проведения
периодического контроля за содержанием ФА в сыворотке крови
больного. Диетическое лечение проводится под постоянным контролем за уровнем ФА и общего белка в сыворотке крови.
Существует возможность предотвращения
или ослабления психических нарушений у больного ребенка при
условии раннего перевода его на специальную диету. Диетическое лечение во
многих случаях оказывается полезным и у детей старшего возраста,
так как, если оно и не предотвращает развития
слабоумия, то нормализует поведение и ликвидирует или ослабляет судорожный синдром.
Эффективность лечения зависит не
только от возраста, начала и длительности лечения, но также от тяжести поражения мозга
ребенка к моменту начала лечения, что, в свою
очередь, может проявляться наличием судорожного синдрома и зависеть от нарушения внутриутробного развития ребенка.
Многие исследователи считают, что
ранняя идентификация мутаций гена ФАГ может служить основой
пренатальной и пресимптоматической диагностик и
повысить эффективность применяемой для коррекции ФКУ диетотерапии и других способов лечения.
Вследствие того, что различные
популяции мира имеют выраженную генетическую
гетерогенность по частоте и характеру мутаций гена ФАГ, то в каждой конкретной популяции необходимо изучать свой спектр мутаций гена ФАГ. Частота ФКУ в республике Башкортостан по результатам массового неонатального скрининга составляет 1:10707 и не отличается от
среднеевропейской. Ее высокая частота также указывает на
необходимость проведения молекулярно-генетического
изучения ФКУ в республике.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы образцы ДНК больных с клиническим диагнозом фенилкетонурия, состоящих на учете в медико-генетической консультации
Республиканской клинической больницы имени Г.Г.Куватова г. Уфы, членов их семей
Обследовано 44 семей с
фенилкетонурией, По этнической принадлежности семьи распределились
следующим образом: 15 русских, 10 татарских, 2
башкирских, 2 чувашских. В 15-ти семьях пробанды происходили
из межнациональных браков. Диагноз фенилкетонурии устанавливался на основании
данных клинического и биохимического обследования.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной
экстракции. Для выделения ДНК к 10 мл крови добавляли 50 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCb, 10мМ трис-НС1, рН 7,6. Полученную смесь
перемешивали и центрифугировали при 4°С, 4000 об./мин. в
течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 8 мл раствора, содержащего25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl, ресуспензировали, прибавляли 0,8 мл 10% SDS, 50 мкл
протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали образец при 37°С в
течение 16 часов. После этого к лизату прибавляли
0,5 мл 5 М перхлората Na и последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяли в дистилированной воде и хранили при -20°С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Для выявления мутации R408W был
использован метод ПЦР/StyI-диагностики,
разработанный Иващенко Т.Э. и др. (Иващенко Т.Э., 1993), который заключается в амплификации фрагмента 245 п.о., включающего 12 экзон и фланкирующие интронные последовательности, с последующей
рестрикцией специфической рестриктазой Styl, которая
расщепляет амплификат только при наличии данной мутации. По окончании электрофореза гель окрашивали
раствором бромистого этидия (ОДмкг/мл) в течение 15 минут и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Размеры аллелей определяли путем рестрикционного анализа.
Для определения мутации R408W мы
проводили гидролиз амплифицированного фрагмента ДНК,
включающего 12 экзон гена ФАГ, рестриктазой Styl в стандартных
условиях: к 10 мкл амплификата добавляли 5 единиц фермента
и инкубировали при 37 С° не менее 12 часов. В результате
этой реакции амплифицированный фрагмент размером 245 п.о.
подвергался ферментативному гидролизу. Полученные гидролизаты разделяли электрофорезом в 7% полиакриламидном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали под ультрафиолетовыми лучами. При наличии в этом экзоне мутации R408W в
гомозиготном состоянии определялись фрагменты длиной 148
п.о. и 97 п.о., а у гетерозигот - 245 п.о., 148 п.о. и 97 п.о.(рис. 1)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ мутации R408W в ФКУ семьях
Самым точным методом молекулярной
диагностики является выявление нарушений в нуклеотидной
последовательности ДНК. Любые типы мутаций могут быть
выявлены путем секвенирования ДНК, но секвенирование всего гена заболевания,
особенно в случае его больших размеров, весьма трудоемко и
дорого. Поэтому в последнее время для идентификации мутаций стал широко
использоваться менее трудоемкий и менее дорогостоящий метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого в то же
время лежит информация, полученная
при секвенировании гена. Суть ПЦР заключается
в направленной высокоспецифической амплификации небольшого фрагмента ДНК, включающего интересующий участок гена, и последующей идентификации наличия (или
отсутствия) мутаций при помощи
рестрикции специфичной рестриктазой (ПДРФ-анализ, если это необходимо) и
электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. Количество ДНК, необходимое для анализа методом ПЦР, минимально, что возможно использовать для пренатальной диагностики
плода из ворсинки хориона.
Высокая доля мутации R408W гена ФАГ в
развитии тяжелых клинических форм заболевания в европейских
популяциях, гипотеза о ее Балто-славянском происхождении,
открытие быстрого и эффективного метода ее
идентифицирования (Иващенко Т.Э., 1993) позволяет использовать данный локус для диагностики и выявления скрытого носительства мутантного аллеля в популяциях смешанного этнического состава, к которым
относится и Башкортостан.
Рисунок 1. Идентификация мутации R408W в гене ФАГ с использованием метода ПЦР у больных ФКУ: 1, 4 – гетерозиготные носители R408W/N; 2, 3 – гомозиготные больные R408W/R408W; 5 – здоровая женщина - гомозигота N/N.
В семьях больных ФКУ был проведен
ПДРФ-анализ мутации R408W гена ФАГ, результаты которого
представлены в таблице 1.
Таблица1
Частота распределения мутации R408W гена ФАГ в семьях больных ФКУ.
|
Больные фенилкетонурии |
Гетерозиготные носители мутации гена |
||||
|
|
ФАГ |
||||
|
|
|
Частота |
|
|
частота |
|
генотип |
п |
распределения |
генотип |
п |
распределения |
|
408/408 |
15 |
0,26 |
408/N |
66 |
0,53 |
|
408/Х |
29 |
0,51 |
X/N |
53 |
0,43 |
|
х/х |
13 |
0,23 |
- |
- |
- |
Примечание: 408 - мутация R408W; X - другие
мутации гена ФАГ; N -нормальный аллель; п - число
обследованных индивидов.Проведенный анализ показал, что в 44
семьях развитие ФКУ было связано с наличием мутации R408W в гомо- или
гетерозиготном состоянии (26 % и 51% соответственно), что определяет степень
информативности семьи для пренатальной диагностики и
верификации диагноза ФКУ. В 23% случаях проявление
заболевания было связано с неидентифицированными мутациями
гена ФАГ.
Аллель, несущая мутацию R408W,
встречается у ФКУ-пробандов в Башкортостане с частотой 0,54 что в
целом соответствует частоте данной
мутации в европейских популяциях . Небольшое снижение частоты
мутации R408W в нашей
выборке, вероятно, можно объяснить гетерогенностью
этнического состава больных ФКУ из Башкортостана, Так, среди 44 семей с идентифицированной R408W мутацией
46,38% (15 пробандов) составили русские семьи, 17,5%
(10) - татарские, по 3,51% ( по 2 пробанда)
чувашская и башкирская семьи и 26,31% (15) - метисные браки (рис.2).
