МЕТОДИКА И РЕЗУЛЬТАТЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕННОГО СТАФИЛОКОККА В РЫБНЫХ ПРОДУКТАХ БАРЕНЦЕГО МОРЯ

Автор: Емченко Анна, Политехнический лицей, 9 класс

Научный руководитель: А.Т. Перетрухина, зав.кафедрой биологии МГТУ,профессор, член корр. РНАН

г. Мурманск

Цель доклада - проведение микробиологических исследования по обнаружению патогенного стафилококка в рыбных продуктах.

Бактерии рода Staphylococcus широко распространены в природе. В настоящее время различают два вида стафилококков – сапрофитные и патогенные. Стафилококки имеют шарообразную форму диаметром 0,8-1 мкм и располагающиеся гроздьями спор, факультативные анаэробы.

На рыбном бульоне дают помутнение среды, позднее - осадок на вторые - третьи сутки кольцо и пленку. Хорошо произрастают в солевых средах. Они образуют разные пигменты: белые, золотистые, лимонно-желтые, вырабатывают ферменты (летициназа, кагулаза и др.), характерные для патогенных видов, а также разжижают желатин, свертывают молоко, продуцируют каталазу, уреазу, выделяют аммиак и водород. Стафилококки способны вырабатывать резо и эндотоксины, устойчивы к действию высокой температуры (t опт.> 30-37⁰).Эти качества позволяют им хорошо сохраняться и накапливаться в соленой, копченой, консервированной рыбе.

Согласно классификации, представленной в определителе Берджи род Staphylococcus

К 14 группе – грамположительные кокки. Род стафилококков входит в семейство Micrococcоccoсea и состоит из 3-х видов. Staphylococcus aureus, Sepidermid, S.siprophilicus.

Патогенный стафилококк впервые был выделен из гноя в 1880 г. Л.Пастером. Дифференциация патогенных стафилококков определяется комплексом свойств и методом фаготипирования (1949 г. Г.Вильсон). Типизация производится по набору 22 типовых фагов. К настоящему времени выделено около 40 фаготипов стафилококков.

Морфология. Стафилококки представлены шаровидными кокками диаметром 0,8-1,0 мкм. Они располагаются в чистой культуре гроздеобразными скоплениями. В неблагоприятных условиях внешней среды стафилококки могут переходить в фильтрующиеся L-формы. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, грамоположительные, легко окрашиваются всеми анилиновыми красками Культивирование: Стафилококки-факультативные анаэробы растут в обычных средах при t=35-37 ⁰С,рН 7,2-7,4; среда-Н 10-ионно-солевой агар.

Ферментативные свойства. При посеве уколом в столбик желатины патогенные стафилококки дают ее воронкообразное разжижение к 4-5 му дню. Они также свертывают, затем пептонизируют молоко, ферментизируют глюкозу, лактозу, сахарозу и маннит с образованием кислой среды без газообразования, восстанавливают нитраты в нитриты, выделяют сероводород.

Токсины и ферменты патогенности. Стафилококки обладают высокой активностью. Экзотоксины и эндотоксины, вырабатываемые стафилококками, воздействуют на организм в единой системе с ферментами. Экзотоксины обладают гомотипическим, некротическим, летальным и аллергическими свойствами. В соответствии экзотоксина различают: гемолизин, повреждающий эритроциты, некротоксин, обуславливающий некроз ткани; летальный токсин, вызывающий гибель живых организмов; энтеротоксин-острое отравление.

К ферментам патогенности относятся: плазмокоагулаза, вызывающая свертывание цитратной плазмы крови; фибролезин - растворение сгустков фибрина; гиалуронидаза-инактивирование гиалуроновой кислоты соединительной ткани.

Стафилококковые интоксикации занимают ведущее место среди отравлений рыбными продуктами в Кольском регионе, основную роль среди которых занимает золотистый стафилококк. Развиваясь в рыбных продуктах, он выделяет особый экзотонин - энтероксин (кишечный яд), к которому человек обладает высокой чувствительностью. К основным местам его обитания у человека относятся слизистые оболочки носоглотки, кожа. Помимо энтероксина он вырабатывает другие токсины, вызывающие у человека различные заболевания (ангина, воспалительные процессы, гнойничковые заболевания кожи), разрушает эритроциты крови, обладает способностью коагулировать плазму крови.

Золотистый стафилококк хорошо развивается в рыбных субстратах, богатых углеводами и белками, устойчив к высоким температурам, солевым средам (до 10-15%). Оптимальная температура размножения и токсинообразования составляет 30-37⁰. При этой температуре в рыбных продуктах (соленая, копченая рыба) за 4-8 часов накапливается количество энтеротоксина достаточное, чтобы вызвать интоксикацию. Стафилококк также интенсивно размножается и образует токсин при комнатной температуре 18-20⁰ . При размножении в свежей рыбе повышенная концентрация токсина обнаруживается при t 15-20⁰ С через 6-10 часов. При t 5-6⁰С размножение стафилококка и токсинообразование резко замедляется, а при 4⁰С прекращается. При отрицательных температурах стафилококк длительное время сохраняется жизнеспособным. Он также выдерживает в течение часа нагревание до 70⁰ С, 20-40 мин. до 80⁰ С. Имеются сведения (Г.Л.Носакова), что некоторые штаммы выдерживают температуру стерилизации и до 100 ⁰ С в течение получаса. Кислые среды неблагоприятны для развития стафилококка, при рН среды <4,5-5,0 его рост приостанавливается.

Энтеротоксин термостабилен при кипячении в течение 30 мин. Для полного его разрушения требуется кипячение около двух часов или нагревание до 120 ⁰ С в течение 30 мин.

Стафилококковые пищевые отравления наиболее часто вызываются рыбными консервами и пресервами с просроченным сроком хранения, нарушением санитарно-гигиенических норм на производстве. Известны случаи отравления при употреблении свежей рыбы с неправильными условиями хранения. Рыбные продукты, зараженные токсическими стафилококками, обычно не имеют внешних признаков порчи. Главным источником стафилококковой инфекции являются лица, страдающие гнойничковым поражением кожи или имеющие токсичные стафилококки в носоглотке или верхних дыхательных путях. Пища также может инфицироваться стафилококком капельками слюны, выделяемой при кашле, чихании, а также непосредственном соприкосновении с руками. Поэтому не рекомендуется допускать на производство лиц, являющимися носителями стафилококковой инфекции.

По данным Н.И. Ревич-Щербо (1956 г.) стафилококк, внесенный в теплое время года в рыбные консервы, уже через 3-6 часов размножается в огромных количествах. В рыбных консервах, зараженных стафилококком, зачастую присутствует энтеротонин. Еще в 1949 г. К.И. Туршецким установленно, что рыбные консервы могут являться причиной стафилококковых пищевых отравлений.

Признаки отравления проявляются в виде острого желудочно-кишечного заболевания через 1-6 часов после приема зараженной пищи. В некоторых случаях отмечаются летальные исходы (см. таблицу А)

Сущность метода.

Метод выявления и определения НВЧ S.aureus посевом с предварительным обогащением, основан на высеве навески продукта и разведения навески продукта в жидкой селективной среде. Инкубирование посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждений по биохимическим признакам принадлежности выделенных характерных колоний Staphylococcus aureus.

Проведение анализа

Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных по ГОСТу 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г/см3 продукта предлагаемое количество Staphylococcus aureus или их количество, указанное в нормативно-технической документации на анализируемый продукт.

При определении количества Staphylococcus aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды по 0,1 или 0,2 см2 продукта или его разведения наносят на поверхность одной из сред Байрд-Паркер агара или яично-желточного агара. Преимущественно для посева используют Байрд-Паркер агар.Для посева продукта или каждого его разведения используют две параллельные чашки Петри со средой.Подготовку чашек Петри со средой к посеву.

При определении количества Staphylococcus aureus по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта или его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них 10 раз. Каждую навеску продукта или его разведения в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с одной из сред.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведения с питательной средой 1:6 или 1:7.

Посевы для выявления Staphylococcus aureus в определенной навеске продукта. При выявлении Staphylococcus aureus в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении вносят в одну из питательных сред.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:6 или 1:7.

При выявлении Staphylococcus aureus в определенной навеске продукта или его эквивалентным разведением без предварительного обогащения эту навеску или разведение в количестве 0,1 см3 ; 0,2 см3 наносят на поверхность одной из селективно-диагностических сред.

При посеве жидких высококислотных продуктов для предварительного снижения рH сахарного или солевого бульона на 0,5 и более PH продукта перед посевом доводят до 70 ±0,2. При посеве твердых высококислотных продуктов доводят PH до 7,0±0,2 в посевах. Если высевают не твердый продукт, а его исходное разведение, то его рH доводят до исходного разведения.

Доведение рH проводят асептически с помощью стерильных растворов, гидроокиси натрия и соляной или лимонной кислоты. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия устанавливают опытным путем.

При анализе пищевых продуктов с большим содержанием NaCl проводят посев продукта или его исходного разведения в сахарный бульон, во всех других случаях для посева используют солевой бульон.

Посевы на агаризованных жидких средах инкубируют при температуре (36 ± 1)0С в течение 48 часов. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них после инкубирования делают посевы петлей на поверхность одной из селективно-диагностических сред. Посевы инкубируют при температуре (36 ±)0С в течение 24-48ч.

Посевы на агаризованных средах после инкубирования просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На Брайд-Паркер агаре колонии S.aureus круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными краями, диаметром 2-2,5 мм, окрашенные в желтый, золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет.

На яично-желточном-азидном и яично-желточносолевом агаре колонии S.aureus окружены зоной лецитиназной активности.

В посевах отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний, и подсчитывают их.

В посевах отмечают рост характерных колоний без подсчета их количества. Подтверждение принадлежности характерных колоний к S.aureus.

Для подтверждения принадлежности характерных колоний к S.aureus отбирают не менее 5 колоний (если в посеве выросло менее 5 колоний, то отбирают все выросшие колонии), и пересевают на поверхность одной из скошенных питательных сред: мясо-пептонного агара.

Посевы инкубируют при температуре (36±1)0С в течение 24 ч. У выросших микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму, способность коагулировать плазму кролика; образовывать каталазу и ферментатировать мальтозу в анаэробных условиях.

Обработка результатов.

В качестве исходного материала были взяты пресервы (банка №27), консервы печени трески (банка №3). Срок хранения пресервов составляет 3 месяца, консервы печени трески – 2 года. В опытную партию входили 1 банка пресервов и 2 банки консервов (одна из которых бомбажная)

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оценка результатов посевов на жидкие среды:

При определении НВЧ S.aureus, посевы считают положительными, если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждений характерных колоний, вырасших на этих средах, хотя бы в одной колонии будут обнаружены S.aureus НВЧ S.aureus в 1 г (см³) (рыбные консервы, пресервы) подсчитывают по количеству положительных посевов,при выявлении S.aureus в какой-либо навеске продукта посевы считают положительными (т.е. S.aureus выявлен в анализирующей навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждений характерных колоний, выросших на этих средах.

Оценка результатов посевов на агаризованные селективно-диагностические среды :

При выявлении Staphylococcus aureus в определенной навеске продукта посевы считают положительными, если при подтверждении характерных колоний, хотя бы в одной колонии будет обнаружен Staphylococcus aureus.

При определении количества Staphylococcus aureus в 1 г/см³ продукта подсчет числа характерных колоний подлежит корректировке в зависимости от результатов подтверждения принадлежности этих колоний к Staphylococcus aureus.

Если при подтверждении характерных колоний в 30% случаев, то есть не менее чем из 5 колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus, то считают, что все характерные колонии принадлежат к Staphylococcus aureus.

В остальных случаях количество харктерных колоний, принадлежащих к Staphylococcus aureus, определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Подсчет количества Staphylococcus aureus на 1г/см³ продукта проводится по ГОСТу 26676.

Результаты определения количества Staphylococcus aureus в 1г/см³ продукта и выявления его в определенной навеске продукта записывают по ГОСТу 26670.

В микробиологической лаборатори на базе биологического факультета МГТУ был проведен анализ продуктов (пресервы, рыбные консервы печени трески) по ГОСТу 10444.2-94.

Для среды был взят солевой бульон.

Из навески продукта 1:10 взяли 5 десятикратных разведений, т.е. в последней содержание продукта 10^-5. 1см³ каждого разведения высеяла в солевой бульон. Инкубировала при t 37⁰С в течение 24 ч. (для консервов была взята навеска).

Для подтверждения роста микроорганизмов в солевом бульоне сделала посев петлей на поверхности селективно-диагностической среды МСА. Посевы инкубировала при Т 37С в течение 24 ч.

.

После инкубирования была визуально изучена агаризованная среда но, характерных колоний для S.aureus обнаружено не было ни на одном из посевов данных продуктов. На пресервах были обнаружены для данного продукта колонии. Для определения бактериальной природы был приготовлен фиксированный мазок окрашенный по Граму. Проведена микроскопия. В результате микроскопии в 1 и 2- ом разведении на пресервы были обнаружены споровые палочки.

Вывод.

. В результате проведенных мной микробиологических исследований по ГОСТу 10444.2-94 патогенный Staphylococcus aureus был обнаружен т.е. данный продукт будет являтся возбудителем стафилококковых отравлений.

При обнаружение патогенного стафилококка анализ продолжался бы , т.е. были бы поставлены тесты на плазмокоагулирование плазмы кролика, образования каталазы, ферментатировать мальтозу в анаэробных условиях.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ГОСТ 10444.2-94 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus.

2. Дутова Е.Н. “Техническая микробиология рыбных продуктов”, Москва 1976 г. “Пищевая промышленность”.

3. Макаров К.А. “Микробиология, Вирусология, Имунология”, изд Казахстан Алма-Ата,1974 г.

4. Мундрецова К.А. “Микробиология”,изд. Москва 1980 г.

5. Перетрухина А.Т. “Практикум по общей биологии”, Мурманск 1997 г.

6. Холт “Определитель бактерий Берджи”, Москва изд. “Мир”.

7. Инструкция о порядке расследования учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях \сэс при пищевых отравлениях. Москва,1975.

8. Инструкция “Санитарная микробиология”, Москва, Пищевая промышленность 1980.

Таблица А.

Клинические симптомы	Коагулазоположительные стафилококки
Инкубационный период	4-12ч.
t^0 температура	Норма, редко субфебральная
Озноб	+-
1.Тошнота	1.++
2.Рвота	2.+++
Боли в эпигостральной области. Боли в области живота.	+ -
Жидкий стул	+-+
С кровью	-
Со слизью	-
Запор	-
Метеоризм	-
Общая слабость, головокружение	+
Головная боль	-+
Растройство зрения	-
Диплодие, птоз, медриаз	-
Расстройство речи, глотания	-
Сухость во рту	-
Потеря сознания	-
Судороги	-
Упадок сердечной деятельности	-+
Расстройство дыхания	-

Условные обозначения :

+++ очень часто ++ симптомы выражены сильно

+ симптомы выражены умерено +- симптомы наблюдаются редко.

-+ очень редко - не наблюдаются

Staphylococcus aureus.

Диаметр >5 мм	+
Пигментация	+
Рост в аэробных условиях	+
Рост в анаэробных условиях	+
Рост на Агаре NaCl (NaCl 10%)	+
Рост при t 15^0С	+
t 45^0C	+
Тест на оксидазу	-
Молочная кислота
L(+) изомер	+
Д(-) изомер	+
Образование кислоты сахарозы Мальтоза	+ +
Д- манитола	+
Д- маноза	+
Лактоза	+
Восстановление нитрата	+
Щелочная фосфотаза	+
Уреаза	+
Коагулаза	+
Фактор слипания	+
Фибринолизин	+
Гемолиз	+
Маннит	+
ДНК-аза	+