ЭКСТРЕМОТОЛЕРАНТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ -
ДЕСТРУКТОРЫ КСЕНОБИОТИКОВ

Автор: Никифоров Алексей, Лицей №33 при КГУ

г.Казань

Деятельность акционерного общества «Нижнекамскнефтехим» стимулирует образование значительных количеств токсичных отходов производства. В процессе биологической очистки сточных вод происходит накопление нерастворимых отходов - нефтешламов. Нефтешламы содержат высокотоксичные вещества, в частности, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). К тому же, благодаря расположению шламонакопителей АО «Нижнекамскнефтехим» на открытой территории, большую часть года температура в них не поднимается выше +10⁰С. Поэтому, в связи с поиском путей утилизации шлама, целью данной работы явилось установление возможности функционирования в нефтешламе бактерий, устойчивых к пониженным температурам.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи : выделить из нефтешлама новые штаммы бактерий, устойчивых к воздействию пониженных температур; изучить деструкторские свойства изолятов по отношению к различным ПАУ; оценить толерантность выделенных микроорганизмов к NaCl.

Материалы и методы исследования

Выделение индивидуальных психротолерантных штаммов микроорганизмов проводили с помощью посева из серийных разведений гомогенизированного нефтешлама в стерильной водопроводной воде. По 0,1 мл соответствующих разведений (от 10^-5 - 10^-7) распределяли шпателем по поверхности МПА. Посевы делали в трех повторностях. Инкубацию проводили в течении 4-5 суток при 12⁰С.

Серийные разведения стерильно гомогенизированных шламовых проб готовили с таким расчетом, чтобы на агаровых пластинках при посеве из конечных разведений вырастало в среднем 20-30 колоний. Это позволило в дальнейшем выделить изоляты из отдельных колоний. Для получения чистых культур проводили повторные посевы на агаризованные среды с последующей изоляцией клеток из отдельных колоний.

Морфология клеток, грампринадлежность, подвижность, спорообразование изучались стандартными методами (Практикум по микробиологии под ред. Егорова, 1976).

Изучение деструктивных свойств выделенных изолятов проводили на плотной питательной среде А следующего состава (г/л дистиллированной воды): (NH₄)₂SO₄ – 1,0; MgSO₄*7H₂O - 0,25; KH₂PO₄ - 3,0; Na₂HPO₄*12H₂O - 4,5; дрожжевой экстракт - 0,3.

В качестве источника углерода использовали различные ксенобиотики: фенантрен (ФЕН), антрацен (АНТ), нафталин (НАФ), дибензотиофен (ДБТ), бифенил (БФ), нефть в концентрации 100 мг/л среды.

Изучение галотолерантности выделенных штаммов проводили на среде МПА с добавлением NaCl. В работе использовали концентрации соли 3, 5 и 10%.

Определение способности изолятов к росту при пониженной температуре проводили на МПА при температуре 5⁰С.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение психротолерантных микроорганизмов.

Татарстан находится в зоне континентального климата, в связи с чем 6 месяцев из 12 температура на его территории не поднимается выше 10⁰С. Поэтому нами было выдвинуто предположение о том, что среди микрофлоры шлама возможно присутствие и психротолерантных микроорганизмов.

Для учета микроорганизмов, устойчивых к воздействию пониженных температур, были проведены посевы шлама методом серийных разведений на МПА. Установили, что количество психротолерантных микроорганизмов, способных расти при +12⁰С, составило 3,4*10⁶ , тогда как общее количество аэробных мезофильных гетеротрофных микроорганизмов составило 2,5*10¹⁰.

Интерес представлял не только количественный учет устойчивых к пониженной температуре микроорганизмов, но и их качественный состав, поэтому было проведено выделение штаммов из этой группы микроорганизмов. Нами было изолировано четыре доминирующих психротолерантных штамма. По морфологическим признакам три из них (PC1, PC3, PC4) были представлены мелкими подвижными грамотрицательными палочковидными бактериями, а штамм PC2 - грамположительными подвижными клетками, образующими цепочки (табл.1). Полученные нами данные согласуются с данными литературы (Mihelcic & Luthy, 1988), которые говорят, что большинство психротолерантных видов бактерий являются грамотрицательными (цит. по Лях,1976).

Таблица 1.

Культуральные и морфологические признаки психротолерантных штаммов

Штамм	Вид колоний на МПА	Форма клеток	Грампринадлежность	Подвижность
РС1	Круглые, мелкие, блестящие, гладкие, выделют в среду коричневый пигмент	Мелкие, палочковидные	-	+
РС2	Круглые, матовые, белые, мелкие	Отдельные палочковидные клетки, иногда собраны в цепочки	+	+
РС3	Круглые, мелкие, блестящие, свело-кремовые	Мелкие, палочковидные	-	+
РС4	Круглые, мелкие, блестящие, кремовые	Мелкие, палочковидные	-	+

Для установления устойчивости изолятов к низким температурам все штаммы культивировали на МПА при 5⁰С. Был выявлен хороший рост штамма РС4 через 4суток культивирования, штаммов РС1 и РС3 - через 7суток. Штамм РС2 не проявил способности к росту на МПА при данной температуре.

Деструкторские свойства выделенных штаммов

В состав нефтешлама входит много сложных химических соединений, к числу которых относятся ПАУ и отдельные фракции нефти. Для установления метаболических свойств выделенных штаммов были использованы такие соединения как нафталин, фенантрен, антрацен, дибензотиофен, бифенил, нефть в качестве источников углерода. Эксперимент проводили при 20^oC

Наибольшей деструкторской способностью отличались штаммы РС1 и РС4. Об этом свидетельствовал рост штамма РС1 на средах с ФЕН, АНТ и нефтью и штамма РС4 на средах с ФЕН, АНТ, ДБТ и нефтью через 2 суток культивирования (табл.2). Через 8 суток культивирования был выявлен рост штамма РС1 и на среде с ДБТ. Штамм РС4 через 8суток проявил рост на средах со всеми предложенными ПАУ (табл.2).

Таблица 2.

Использование психротолерантными штаммами различных ксенобиотиков в качестве источника углерода и энергии.

Штамм

нефть

ФЕН

АНТ

НАФ

БФ

ДБТ

А

Б

А

Б

А

Б

А

Б

А

Б

А

Б

PC1

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

+

PC2

-

+

-

+

-

+

-

-

-

-

-

+

PC3

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

PC4

+

+

+

+

+

+

-

+

-

+

+

+

+ наличие роста, - отсутствие роста

А - 2 сутки культивиования

Б - 8 сутки культивиования

Штаммы РС2 и РС3 обнаружили более низкие темпы роста на средах с ПАУ и нефтью. Тем не менее, продление культивирования до 8 суток позволило выявить рост штамма РС2 на средах с АНТ, ФЕН и ДБТ и рост штамма РС3 на средах с АНТ и ДБТ (табл.2).

Интересным является тот факт, что штаммы РС1, РС2, РС3 не используют НАФ в качестве источника углерода, так как он является соединением с меньшей молекулярной массой и меньшим числом колец, чем ФЕН, АНТ и ДБТ, которые имеют три кольца. Отсутствие роста штаммов РС1, РС2 и РС3 на средах с БФ объясняется тем, что бифенил - очень токсичное соединение с трудом поддающееся биодеградации.

Галотолерантность выделенных изолятов.

Нефтешлам является гидрофобной средой. Поэтому количество доступной воды в нем ограничено, несмотря на высокую влажность.

В качестве фактора, повышающего осмотическое давление в среде культивирования, нами была взята соль NaCl в различных концентрациях (3%, 5%, 10%). Эксперимент проводили при температуре 20⁰С.

Таблица 3.

Галотолерантность выделенных штаммов.

Штамм	3%	5%	10%
РС1	+	-	-
РС2	+	+	-
РС3	-	-	-
РС4	-	-	-

+ наличие роста, - отсутствие роста

Отсутствие роста всех изолятов на средах с добавлением 10% NaCl свидетельствует о сравнительно высокой чувствительности микроорганизмов к возрастающим концентрациям соли.

Штамм РС2, при наличии у него устойчивости к 5% концентрации NaCl, не проявил роста на твердой питательной среде при пониженной температуре (5⁰С). Это согласуется с данными литературы (Kawamura et al., 1994) о способности некоторых микроорганизмов к росту при высоких концентрациях этой соли, при отсутствии у них психротолерантности.

Таким образом, из нефтешлама выделены четыре психротолерантных штамма бактерий. Изолированные штаммы являются деструкторами нефти и ряда полициклических ароматических углеводородов, таких как нафталин, фенантрен, антрацен, бифенил, дибензотиофен. Наибольшая активность характерна для штамма РС4. Среди изолятов наибольшей солеустойчивостью (5% NaCl) обладал штамм РС2.

ЛИТЕРАТУРА

1. Лях С.П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам. // М.: Наука. 1976. - C.160.

2. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова // М., Изд-во Моск. ун-та. 1976. - 307с.

3. Kawamura K., Suzuki I., Fujii Y., Wanatade O. Ice core record of polycyclic aromatic hydrocarbons over past 400 years. // Naturwissenschaften. - 1994. - V.81. - P.502 -505.

4. Mihelcic J.R., Luthy R.G. Degradation of polycyclic hydrocarbons under various redox conditions in soil-water systems. // Appl. Environ. Microbiol. -1988b. - V.54. - P.1724-1730.